Webcode: 01021296

Identifizierung von Hefen als spezifische Mastitiserreger

Im Rahmen der unten beschriebenen Studie wurden Hefestämme aus Milchproben von an subklinisch und klinisch erkrankten Milchkühen isoliert und anhand biochemischer Analysen auf Speziesebene differenziert. Auf Basis dieser Ergebnisse soll eine sichere und kostengünstige Schnellmethode für den Nachweis von Hefen als spezifische Mastitiserreger entwickelt werden.

Kenntnisstand und Zielsetzung
Bei der Mastitis des Rindes handelt es sich um eine entzündliche Reaktion des Milchdrüsengewebes mit infektiöser, traumatischer oder toxischer Ursache (Krömker, 2007).

Durch Hefen verursachte Infektionen des Milchdrüsengewebes beim Rind können zu klinischen Mastitiden mit akutem bis chronischem Verlauf führen (Grunert, 1996). Bei akuten Infektionen kommt es zu einem raschen Anschwellen des Euters und kurzzeitigem Anstieg der Körpertemperatur (Grunert, 1996). Infektionen mit Hefen führen zudem zu einer Absenkung der Milchleistung der betroffenen Euterviertel sowie zu einem starken Anstieg des Gehalts an somatischen Zellen im Milchsekret in den Millionenbereich (Grunert, 1996; Krömker, 2007).

Hefemastitiden können häufig eine Folge des unsachgemäßen und unhygienischen Einbringens von Medikamenten in das Euter sein (DVG, 2009). Aufgrund ihres ubiquitären Vorkommens in Milchviehbeständen (Futtermittel, Einstreumaterialien, Melkanlagen (Hoedemaker, et al., 2006; Krömker, 2007) sind Hefen aber auch oftmals als Kontaminanten in Rohmilchproben vorzufinden (Krömker, 2007).

Als häufige Erreger von Hefemastitiden werden Spezies der Gattung Candida (C.) beschrieben. De Casia dos Santos und Marin (2005) wiesen in 17,3 % der Milchproben aus an klinisch und subklinisch erkrankten Eutervierteln C. krusei gefolgt von C. rugosa sowie C. albicans und C. guilliermondii nach. Farnsworth und Sorensen (1972) führen C. krusei, C. parakrusei, C. guilliermundiund C. tropicalis als die häufigsten isolierten Spezies auf. Hefegattungen wie Rhodotorula spp., Cryotococcus spp.,Trichosporon spp. und Geotrichum spp. wurden ebenfalls als Infektionserreger beschrieben (Hoedemaker et al., 2006).

Antibiotische Therapeutika sind bei Hefemastitiden unwirksam und begünstigen bei einer Applikation das Wachstum dieser Mikroorganismen im Drüsengewebe. Daher ist eine schnelle Identifizierung des mastitisverursachenden Erregers von Bedeutung. Zur diagnostischen Klärung der Pathogenität von Hefen werden die Bildung von Pseudohyphen, die Laktoseassimilation sowie die Fähigkeit des Wachstums in einem Temperaturbereich von 37 bis 40°C herangezogen (Mehnert et al., 1964).

Auf Äskulinblutagar sind diese Mikroorganismen meist erst nach 48 Stunden nachweisbar. Aufgrund der vielfältigen Koloniemorphologie dieser Erregergruppe ist eine Diagnose nur durch die mikroskopische Untersuchung möglich (DVG, 2009), ermöglicht jedoch keine sichere Differenzierung innerhalb der Erregergruppe auf Gattungs- oder Artenebene. Kulturelle und biochemische Nachweisverfahren zur Identifizierung von Hefen sind jedoch zeit- und kostenintensiv.

Im Rahmen dieser Studie wurden Hefestämme aus Milchproben von an subklinisch und klinisch erkrankten Milchkühen isoliert und anhand biochemischer Analysen auf Speziesebene differenziert. Auf Basis dieser Ergebnisse soll eine sichere und kostengünstige Schnellmethode für den Nachweis von Hefen als spezifische Mastitiserreger entwickelt werden.

Material und Methoden
Für die Differenzierung auf Speziesebene mit Hilfe biochemischer Eigenschaften wurden insgesamt 38 Hefestämme herangezogen. 31 Stämme wurden aus Proben von an Mastitis erkrankten Eutervierteln isoliert. Sieben Isolate stammten aus Viertelgemelksproben, aus denen ≥ drei umweltassoziierte Erregerarten nachweisbar waren. Kuhassoziierte Keime wurden dabei nicht nachgewiesen.

0,01 ml der Milchproben wurden auf Äskulinblutagar (Oxoid) ausgestrichen und für 48 Stunden bei 37 C bebrütet. Anhand mikroskopischer Untersuchungsverfahren wurden die Hefestämme identifiziert und für weitere Untersuchungen auf Äskulinblutagar subkultiviert. Die Differenzierung der Isolate auf Spezieseben erfolgte mit Hilfe des API® 20 C AUX (BioMérieux) auf Basis verschiedener Kohlenhydratassimilationsreaktionen.

Ergebnisse
Von den aus Mastitisproben isolierten Hefestämmen konnten 87 % (27/31) der Gattung Candida zugeordnet werden. Davon konnten 63 % (17/27) als Candida rugosa identifiziert werden. Des Weiteren wurden jeweils 11 % der Isolate als Candida famata (3/27) bzw. Candida krusei/inconspicua (3/27) differenziert sowie jeweils 3,7 % als Candida boidini (1/27), Candida lusitaniae (1/27), Candida magnoliae (1/27) und Candida zeylandoides (1/27). Neben Candida-Spezies wurden zudem drei Hefestämme isoliert, welche als Cryptococcus laurentii (10 % (3/31)) identifiziert werden konnten sowie ein Stamm, der als Trichosporon mucoides (3 % (1/31)) differenziert wurde.

Bei den sieben Hefestämmen, isoliert aus verschmutzen Proben, konnten drei Stämme als Candida guilliermondii, zwei Stämme als Candida famata und jeweils ein Stamm als Candida krusei/inconspicua bzw. Pichia ohmeri identifiziert werden.

Fazit
Im Rahmen des Projektes konnten 87 Prozent der Hefeerreger der Gattung Candida zugeordnet werden, wobei Candida rugosa der häufigste nachweisbare Infektionserreger aus der Gruppe der Hefen war. Für Mastitiden verursacht durch Hefen ist eine schnelle Identifizierung dieser Erreger notwendig, da der Einsatz von Antibiotika zu einer Begünstigung des Erregerwachstums in den betroffenen Vierteln führen kann. Kulturelle und biochemische Identifizierungsmethoden dieser Erreger sind zeitintensiv. Eine sichere Schnellmethode zur Identifizierung von Hefen als Mastitiserreger bietet die Polymerasekettenreaktion (PCR).

Im Rahmen des Projektes wurde eine Methode mit Hilfe dieser Anwendungstechnik zur Identifizierung von Hefen aus Herdensammelmilchen unter Anwendung von Universalprimern sowie gattungsspezifischen Primern für Candida entwickelt. Die Nachweisgrenze liegt dabei bei einer Keimdichte von 1,0 pro ml, wobei zeitintensive kulturelle Anreicherungsverfahren nicht notwendig sind. Auf Basis dieser Erkenntnisse zur Identifizierung von Hefen als spezifische Mastitiserreger anhand biochemischer Eigenschaften soll in weiteren Untersuchungen eine PCR-Nachweismethode entwickelt werden, in der zusätzlich der Nachweis von Candida rugosa ermöglicht wird.

Danksagung
Wir danken dem Labor der MBFG, Wunstorf für die Überlassung einiger Hefeisolate aus Mastitismilchen.

Autoren:
Claudia Zinke, Lying Pan und Prof. Dr. Volker Krömker, Hochschule Hannover, Fakultät II- Maschinenbau und Bioverfahrenstechnik, Dr. Friederike Reinecke, LWK Niedersachsen, Eutergesundheitsdienst

Literatur
de Casia dos Santos R, Marin JM (2005). Isolation of Candida spp. from mastitic bovine milk in Brazil. Mycopathologia 159: 251 - 253.

Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft e.V. (DVG) (2009). Leitlinien Entnahmen von Milchproben unter antiseptischen Bedingungen und Isolierung und Identifizierung von Mastitiserregern. 2. Auflage.

Farnsworth RJ, SorensenDK (1972). Prevalence and Species Distribution of Yeast in Mammary Glands of Dairy Cows in Minnesota. Can. J. comp. Med.36: 329 - 332.

Grunert E (1996). Euterkrankheiten. In Buiatrik. Kurzgefasste Darstellung. Band I. Euterkrankheiten, Geburtshilfe und Gynäkologie, Andrologie und Besamung. 5. Auflage. Hannover. Verlag Schaper 1996: 45 - 68.

Hoedemaker M, Schmidt A, Keller B, Bleckmann E, Böhm KH (2006). Isolation von Hefen aus Milch von Kühen mit Mastitis und aus Tupferproben von der Melkanlage. Praktischer Tierarzt 87: 890 - 898.

Krömker V (2007). Ökologie der Mastitiserreger. In: Krömker V (ed.): Kurzes Lehrbuch der Milchkunde und Milchhygiene. 1. Auflage. Stuttgart. Parey Verlag 2007: 60.

Mehnert B, Ernst K, Gedek W (1964). Hefen als Mastitiserreger beim Rind. Zbl Vet Med Reihe A, 1964; 11: 96 - 121.


Kontakt:
Dr. med. vet. Friederike Reinecke
Tierärztin im Eutergesundheitsdienst
Telefon: 0441 801-641
Telefax: 0441 801-666
E-Mail:


Stand: 26.09.2012